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实验目的:使用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠P53基因,获得P53基因敲除小鼠模型。

实验原理:Cas9蛋白与特异性sgRNA在体内形成复合物,识别并切割P53基因的指定位点,经过细胞修复最终导致基因敲除。

实验材料:1.Cas9质粒(px)和sgRNA质粒:分别表达SpCas9和sgRNA;2.用于胚胎注射的Cas9mRNA和sgRNA;3.小鼠原代成纤维细胞(MEF)和胚胎干细胞(ESC);4.荧光定量PCR引物等。

实验步骤:

1.设计sgRNA,选择P53基因外显子区域的靶位点,确保其具有高敲除效率;2.构建sgRNA表达质粒,以U6启动子驱动sgRNA表达;3.将Cas9和sgRNA质粒共转染MEF和ESC细胞,提取基因组DNA,PCR扩增靶位点区段,测序鉴定是否存在突变;4.从转染细胞中选择具有明显大小变化的PCR产物,测序确定突变类型(插入或删除);5.选择转染效率高且突变频率达到30-50%的sgRNA进行原代胚胎注射;6.对注射胚胎进行荧光PCR,选择具有靶基因敲除的胚胎移植;7.生成小鼠并测序验证P53敲除情况,获得P53KO小鼠模型。

sgRNA设计:sgRNA设计是实现高效基因敲除的关键步骤。需要考虑的因素包括:

(1)靶向外显子区域,避免内含子;(2)靶位点附近缺乏多态性;(3)避免近端有重要的调控序列;(4)不同sgRNA的敲除效率可能差异较大,需设计3-4个sgRNA进行筛选。2.构建表达载体:通常使用U6启动子驱动sgRNA表达,CMV或EF1α启动子驱动Cas9表达,并在两者之间包含2A自我剪切肽以实现硬连接。3.转染与筛选:选择Lipofectamine或电转染法实现高效转染,荧光PCR或T7E1体外切割实验准确评估不同sgRNA的敲除效率,选择最佳sgRNA进行后续实验。4.动物注射与筛选:MEF或ESC细胞转染遗传稳定性更好,更适宜用于后续的胚胎注射实验。荧光PCR可以在注射后立即对胚胎进行敲除效率检测,避免无效的移植实验。5.后续鉴定:小鼠出生后,需要提出不同组织(脑、肝、肾等)的DNA进行Sanger测序,确保获得全身P53基因敲除的小鼠。同时需要对模型进行表型分析,确认是否存在与P53基因相对应的表型变化。6.实验优化:可从sgRNA、Cas9表达载体、转染方法和胚胎注射技术等方面进行优化,提高基因敲除的整体准确性和效率。实验结果:成功获得н课导入突变的MEF、ESC及小鼠胚胎,最终获得P53基因敲除的小鼠模型。

实验报告:CRISPR-Cas9系统实现了P53基因在小鼠模型中的敲除,获取了P53基因KO小鼠,为深入研究P53基因在小鼠中的功能提供了重要模型。但该技术也存在一定specificity和效率的问题,需要不断优化sgRNA设计和注射条件以改善其准确性。

名称：重组CRISPR-Cas9蛋白规格：/pmol表达系统：E.coli价格：/0存储条件：-20°C

产品介绍：

来自S.pyogenes的Cas9核酸酶是依赖于RNA介导的内切核酸酶，可以特异地切割双链DNA（在DNAPAM存在的情况下，也可以切割单链DNA或单链RNA）。Cas9切割位点位于目标序列（targetsequence）内，离PAM（NGG）区3个碱基。PAM对于Cas9的识别和切割都是必需的。因为反应需要添加RNA（sgRNA或者crRNA:tracrRNA），整个体系，包括Cas9酶都不能含有任何RNase活性。其中，Cas9中的HNH和RuvC结构域分别负责切割靶标DNA中与sgRNA配对和非配对的链。在本产品中，Cas9的H和D10都被突变为A，使Cas9的HNH和RuvC结构域均失活，获得dCas9蛋白。因此，dCas9只有结合靶标DNA的活性，而没有切割靶标DNA的活性

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