当前位置： 模型材料 >> 模型材料优势 >> 复旦大学方明亮陈建民自然纳米技术可
揭示可降解塑料微粒在体内的健康风险！
微塑料(MPs)在水生和陆地环境中普遍存在，因其对环境和人类健康的潜在风险而成为世界上最紧迫的环境问题。MPs在环境中转移，并通过食物链和直接吸入或摄入人体进行生物累积。虽然人类暴露于肺炎支原体的确切数量存在很大的不确定性，但研究初步估计，每周经口摄入的肺炎支原体摄入量范围为0.1~5.0g。因此，MPs已在人类粪便中检出。对小鼠、牡蛎和贻贝的研究表明，暴露于与环境相关的MPs可导致生殖障碍、DNA损伤和神经毒性。虽然许多研究调查了微粒造成物理损伤的原因、投料量的减少或有毒化学品的浸出，但导致这些影响的机制主要是未知的。
基于此，复旦大学方明亮教授/陈建民教授和安徽医科大学黄以超教授合作证明了在胃肠道过程中，聚乳酸微塑料通过竞争甘油三酯降解酶而产生纳米塑料颗粒。通过疏水驱动的自聚集形成纳米颗粒低聚物。在小鼠模型中，聚乳酸低聚物及其纳米颗粒在肝、肠和脑中生物聚集。水解低聚物引起肠道损伤和急性炎症。
大规模药效团模型显示低聚物与基质金属蛋白酶12相互作用。在机制上，低聚物与催化锌离子指结构域的高亲和力(Kd=13.3μmolL?1)导致基质金属蛋白酶失活，这可能介导了暴露于聚乳酸低聚物后的不良肠道炎症效应。可降解塑料被认为是解决环境塑料污染的一种解决方案。因此，了解生物塑料的胃肠道命运和毒性将有助于了解潜在的健康风险。相关工作以“Oligomernanoparticlereleasefrompolylacticacidplasticscatalysedbygutenzymestriggersacuteinflammation”发表在《Naturenanotechnology》。
图1.胃脂肪酶消化PLAMPs聚乳酸MPs降解的体外消化模型
研究者首先测试了PLAMPs(直径25μm)与不同的消化液反应。在胃液和肠液中进行人工体外消化后，扫描电子显微镜(SEM)图像显示PLAMPs表面粗糙，这可能是生物降解的迹象。用脂肪酶分别从胃液和肠液中降解MPs以确定原因。经胃脂肪酶处理的PLAMPs表面显示出实质性的修饰(图1a)。
PLAMPs在含有小肠脂肪酶的磷酸盐缓冲液(PBS)中在37℃下生物降解3天。SEM分析显示，随着孵育时间的增加，表面磨损增加(图1a)。因此，研究者假设脂肪酶在胃液和肠液中水解PLA，可能是由于PLA的羧基酯键和脂肪酶的丰度。扫描电镜图像进一步显示了数百个纳米直径的球形颗粒悬浮在一起(图1b)。此外，在含胃脂肪酶的PBS中消化2h后，PLAMPs的质量(10mg)下降了5%。接下来，研究者发现，在含小肠脂肪酶的PBS中生物降解的PLAMPs的质量在6h后迅速下降了其初始质量(10mg)的15%(图1c)。
仅在mgml-1组观察到缓冲液pH值降低。作为对照，聚苯乙烯(PS)MPs经脂肪酶处理后PLAMPs的分子和晶体结构没有明显变化。为了进一步评估PLA与消化脂肪酶之间的相互作用，我们以甘油三酯作为阳性对照，研究了酶对脂肪酶的竞争。PLA结合消化脂肪酶，通过竞争性结合阻止甘油三酯降解(图1d)；但在PS塑料的上清液中没有观察到影响。
图2.PLA纳米塑料形成的表征消化过程中纳米塑料释放的机制
接下来，研究者模拟了消化过程，看看纳米塑料是如何产生的。中浮层显示，纳米塑料的数量是6.09×粒子每毫升2h后胃脂肪酶消化。通过将PLAMPs和小肠脂肪酶在37°C孵化6h（浓度从0.1到.0mgml-1），研究者观察到纳米塑料的形成存在剂量依赖的相关性,与第一个3h展示最伟大的收益率(图2),但之后略有下降。此可能系由于所生成粒子或相关寡聚物之持续解聚所致;然而，当底物浓度为mgml-1时，这种缓慢的速率被逆转。为了进一步验证这些处理的解聚作用，我们应用高分辨率质谱方法对最终产物进行了探测。
我们的半定量高分辨率质谱方法确定了不同低聚物的生成，并且在不同PLA浓度的处理中观察到所有低聚物的数量增加。相比之下，没有酶处理的PLA没有变化。假设释放的纳米塑料呈球形，估计10和mgml-1PLAMPs产生的质量分别为(0.48±0.13)和(5.08±0.42)μgml-1。为了确定聚乳酸微粒的化学结构，原子力显微镜-红外光谱法进行了研究。结果证实形成的纳米颗粒为PLA，波数为cm?1处的特征带对应C=O拉伸(图2b)。酶解2小时后PLA纳米粒子的平均尺寸为nm，酶解1天后PLA纳米粒子的平均尺寸为50nm(图2c)，酶解2天后PLA纳米粒子的平均尺寸趋于稳定。有趣的是，透射电子显微镜图像显示纳米塑料有几个核心，这表明颗粒可能自聚集(图2d)。
根据动态光散射测量(图2e)，在稀释后聚集的纳米塑料的尺寸显著减小。我们还观察到在Tween20存在下纳米粒子的尺寸减小。GPC分析显示，在消化PLAMPs的缓冲液的低分子量范围(约Da)内存在微小的峰(图2f)，可能是解聚产生的过量酯低聚物。使用高分辨率质谱对精确寡聚物单元的进一步分析表明，8个单元的寡聚物是最丰富的(图2g)。
为了确定PLA寡聚物是否可以自聚，我们将分子量为Da的寡聚物溶解到PBS中，在显微镜下观察到大量的粒子(图2h)，在浓度为0.5mgml-1的情况下观察到散射粒子。纳米粒子追踪分析(NTA)调查进一步发现形成纳米粒子的最低浓度为0.01mgml-1。当研究者下一步进行分子动力学模拟来分析PLA低聚物的自身相互作用时，我们发现这些相互作用的亲和力强烈依赖于单元的数量，因为更多的单元参与了疏水相互作用(图2i)。这一发现与使用高分辨率质谱和GPC分析确定的观察到的分子质量一致。
图3.聚乳酸纳米塑料/低聚物在体内和体外的生物分布和组织病理学所产生的纳米颗粒和寡聚物的吸收
为了阐明所生成的纳米颗粒的摄取，研究者建立了生物利用度预测模拟模型、体外模型和体内模型。ADMETlab2.0预测，较短的PLA低聚物具有更有利的生物利用度。接下来，为了研究释放的纳米塑料或低聚物是否可以在体外被肝细胞摄取，研究者用荧光PLA纳米塑料和荧光低聚物处理HepG2。两种图像均显示出高信号强度，PLA低聚物发射出更高的信号(图3a)。这些结果表明，纳米粒子和低聚物在体外进入细胞。该发现被另外两个体外模型(人结直肠腺癌细胞和人脐静脉内皮细胞)进一步验证。为了进一步了解PLAMPs的体内暴露相关性，研究者将荧光PLAMPs和荧光低聚物注射给小鼠一周，追踪它们的组织生物分布和肠道内容物。
根据目前的数据显示，人类每周可能摄入0.1-5.0gMP5，小鼠最初以每天1.0mg的剂量服用PLAMPs和低聚物。荧光结果显示PLA在小鼠体内广泛分布(图3b)。此外，摄入的PLAMPs在肠道中以小片段(亚微米)的形式存在(图3c)，证实了体内降解和解聚。PLA纳米粒子和低聚物的荧光信号主要集中在肝脏、肠道和结肠(图3d)。此外，进一步的体外成像证实了这一观察结果(图3e)，研究者在两组的肝和脑样本中均观察到明显的荧光点。相比之下，用低聚物处理的小鼠肝脏和肠道中观察到更强的信号。
图4.聚乳酸寡聚物灭活MMP12低聚物介导炎症的可能蛋白靶点
为了确定炎症的潜在机制，研究者首先测试了肠道微环境的pH值，因为PLA的水解可能会释放酸性基团。结果显示，在给定的剂量下，缓冲液的效力变化很小，这表明酸度不太可能解释毒性。研究者进一步假设低聚物通过直接与某些促炎蛋白相互作用来调节炎症。
虽然没有关于PLA寡聚体-蛋白质相互作用的公开数据，但通过整合GPC结果和质谱数据，我们通过药效团模型(图4a)筛选了一个八聚体与16,种蛋白质的结合亲和力。结果表明，PLA(8个单位)-基质金属蛋白酶12(MMP12)的适应度得分最高。计算分析进一步表明，寡聚体单位长度对应的MMP12催化位点亲和力在10个单位后趋于稳定(图4b)。研究者进一步发现，随着PLA单位数的增加，PLA的羧基氧与锌离子发生静电作用。当寡聚体单位数达到11时，这种静电力开始明显减弱。因此，研究者假设PLA低聚物和MMP12之间没有有利的疏水和氢键相互作用，它们的吸引力主要是由于羧基氧和锌离子之间的静电接触。为了进一步验证这种相互作用，研究者进行了等温滴定量热法，结果表明，MMP12纯PLA寡聚体(图4c)的结合亲和力(Kd)为13.3μM，水解产物(图4d)的结合亲和力(Kd)为20.5μM。
为了研究寡聚物的免疫毒性，研究者测定了RAW.7产生的MMP12生物活性和C3a,C5a和TNF-α的浓度。当用PLA寡聚物的可溶性水解产物处理时，MMP12的生物活性减弱，伴随着C3a、C5a和TNF-α浓度的升高(图5b、d)。暴露于PLAMPs和PLA纳米塑料显示出MMP12生物活性降低和C3a、C5a和TNF-α浓度增加的趋势(图5a、c)。目前的体内表型数据证实，虽然研究者检测到肝、小肠和结肠中的C3a和C5a浓度增加，但PLAMPs和PLA低聚物处理的小鼠表现出类似的MMP12生物活性降低(图5e-g)。值得注意的是，低聚物引起了更剧烈的炎症效应，这进一步证实了低聚物的免疫调节作用。图5.聚乳酸低聚物诱导MMP12失活介导的肠道炎症在本研究中，研究者观察到在真实的人类暴露剂量下，暴露于PLAMPs的小鼠的肠道和结肠出现了严重的炎症。值得注意的是，观察到的炎症可能是由水解和重组引起的低聚物引起的，而不是由PLA的直接颗粒碎片引起的。有证据表明，PLA的生物降解会因其降解产物的酸性而导致大量免疫细胞浸润和炎症33。
然而，在我们的实验中，消化液的pH恒定，这提示pH在肠道炎症中的作用很小，这与经口给予聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)纳米粒子(每日口服12mg/kg，持续21日)后肠道环境中性pH的其他研究一致。研究者以八聚体为聚乳酸水解的主要寡聚物，利用计算机模拟配体-蛋白相互作用模型，在最知名的药物靶点蛋白中筛选可能的靶点。结合实验验证，研究者证实了关键免疫调节剂MMP12的PLA寡聚物的失活可能为PLA在免疫调节中的作用提供了解释。由于MMP12的主要作用是控制组织的紧密性和通透性，因此MMP12是为炎症消退奠定基础的关键介质。此外，MMP12可使补体C3失活以减少补体活化，并使趋化过敏毒素C3a和C5a失活。这种PLA寡聚物-MMP12相互作用提供了对PLA诱导炎症机制的见解。
文章来源：高分子科学前沿
