微挤出式生物3D打印由于使用材料范围广，成为目前主流的生物打印技术，但其无法再现组织器官中复杂微结构。由于对墨水粘度的要求，使得3D打印结构中细胞密度通常低于生理组织密度，影响细胞间连接和组织功能实现。近日，瑞士洛桑联邦理工学院的Serex,L团队在Biofabrication期刊上发表题为“Microfluidic-assistedbioprintingoftissuesandorganoidsathighcellconcentrations”的文章，介绍了一种基于微流控芯片的3D打印喷头，能够实时调节3D打印墨水中细胞密度，并可实现密度每毫升高达细胞的成纤维细胞，可用于打印膀胱类器官。细胞接种密度对于3D培养中的器官形成至关重要，因此类器官打印可以获得标准化类器官和可重现的结果。

体外3D生物模型可作为研究工具，用于药物测试，或替换患者受损的器官。目前，从生物3D打印到活体纤维的直接编织，多种方法正被应用于在体外构建3D生物模型。其中，生物3D打印迅速发展，打印复杂度、稳定性和细胞活性不断提高。微挤出式生物3D打印已成为主流方法。它易于使用，对打印细胞损伤小，能够进行多种材料打印，并且可以与多种生物相容材料一起使用。开发更好的生物墨水通常被认为是进一步推进活体组织生物3D打印的关键。细胞还必须在打印组织中足够靠近，以便通过细胞因子和趋化因子等可扩散物质进行相互间通讯。在打印组织中建立细胞间联系，生物墨水中的细胞密度将发挥重要作用。因此，生物3D打印的其中一个目标是生产高细胞密度的组织。到目前为止，只有少数研究能够实现在高细胞密度下成功地进行生物打印。且并非使用微挤出式生物3D打印机。

1．制造打印头

如图1（A）所示，打印头需实现集中器功能与混合功能两个功能。在上游浓缩打印机管道中仍为低粘度的标准细胞培养基。然后用所需量的ECM稀释浓缩的溶液，并在分配之前在人字形混合器中混合。集中器功能由横流滤波器实现。它由主通道与侧通道组成，其中通过侧通道抽出多余的液体沿所述通道形成密度梯度。两排平行的柱作为切向滤片，侧通道不能通过细胞。混合器为人字形，遵循Stroock,AD等人提出的设计规则’微通道混沌混频器”。这种混合器在低雷诺数下混合流体非常有效。因此，尽管过滤器只能在有限的粘度范围内工作，但在短距离内，由于有混合器的存在，浓缩后可以再添加并混合粘性ECM。综上，该微流控分配工具可用于高粘度材料，如胶原蛋白或基底膜提取物（BME），并已在高达60mPas的粘度下进行了测试。

打印头通过微机械制造手段实现，如图1（B）所示，在主入口（i1）中引入低细胞密度溶液。溶液沿着过滤柱（流f1）流动，通过二次入口（i2）施加负流，可以抽出细胞周围多余的介质（流f2），从而在中央通道中形成浓缩溶液（流f4）。最后，可以通过第三个入口（i3）添加ECM，并使用人字形混合器（流量f5）进行混合。带有ECM的均质细胞浓缩溶液最终通过出口分配。

图1微流控打印头的功能与结构

2．细胞培养

该团队使用两种细胞进行实验：NOR10成纤维细胞和原代小鼠膀胱上皮细胞。为了制备类器官，该团队处死了三只四个月大的C57Bl/6小鼠。用微量注射器将胰蛋白酶注入离体和钳制的小鼠膀胱，从小鼠膀胱中提取尿上皮细胞。微量注射后，将夹持的小鼠膀胱置于含有20mlDMEM培养基的50mlFalcon管中，并在37℃和5%CO2下培养1h。膀胱用含20%FBS的DMEM冲洗，以中和胰蛋白酶的作用。将分离的细胞以高密度接种在Cultrex基膜提取物中，以促进小鼠膀胱类器官的形成。进行生物打印前，用胰蛋白酶降解BME制备单细胞悬浮液。

使用这种悬浊液制备成的中每毫升个细胞的小鼠膀胱培养基溶液，通过入口i1打印BME半球形穹顶，同时通过入口i3打印BME半球形穹顶。在含有75%BME和25%小鼠膀胱培养基的溶液中，设置流速，产生具有每毫升、或万个细胞的圆顶。圆顶直接印在预热的FluoroDishTM孵育板上。将培养板倒置放置在培养箱中15分钟，以使细胞沉积到圆顶顶部，并使BME交联。然后将小鼠膀胱培养基添加到培养皿中，培养皿在37℃下培养两周以形成类器官。

3.细胞悬液密度

为了表征打印头的浓缩能力，阻塞入口i3，仅使用入口i1和i2（图1（B））。改变两个入口的流速比率，并针对每个比率在打印头尖端收集五个相同体积的液滴以评估获得的细胞密度和细胞活力。将液滴收集在带有缓冲溶液的容器中，以确保均匀的细胞分布。打印头可将细胞悬浮液的密度增加一个数量级。NOR-10成纤维细胞呈细胞富集状态，图2（A）表明，两种不同细胞悬浮液（75万细胞/mL和万细胞/mL）的密度都增加至10倍以上。

细胞密度不随通过侧通道从主通道中抽出的液体量线性增加，因为在高密度下，只有少量液体留在通道中。在横向通道中抽出少量液体，从而导致密度的高度变化。图2（a）绘制了这个简单模型，与测量值吻合良好。该设备对方向或加速度不敏感，这对于3D打印头的实现至关重要。使用这种打印头，可以很容易地获得高于万个细胞/mL的细胞密度，而其他类型的浓缩器则不是这样。

在通过浓缩装置后，对样品进行活/死分析以评估细胞活力。细胞活力平均保持在97%以上。支持信息和分析方法中提供了流量比的可行性。

图2细胞密度随打印头主侧通道流量比变化模型

4.胶原中NOR-10细胞的富集、混合和打印

在使用入口i3打印之前，将细胞溶液浓缩至每毫升0万个细胞，并用胶原蛋白稀释2倍。直接在荧光皿中进行打印。通过入口i1的细胞悬浮液使用的流速为1ls-1；入口i2使用的流速为0ls-1到负0.9ls-1；通过入口i3的胶原蛋白使用的流速为1ls-1到0.1ls-1。这些条件使液体在分配工具中的停留时间在3到25s之间，打印速度在33到3.3mms-1之间，具体取决于i1和i2之间的流量比。将浓缩培养物培养3天，对细胞进行肌动蛋白和细胞核标记物染色，以评估其扩散和密度。结果如图3所示，高密度组的细胞达到融合，铺展性好于低密度组。

图3低和高细胞密度的打印结构

5.类器官生物打印

该团队通过将小鼠尿路上皮细胞接种于BME中，并将细胞悬浮液作为直径为1cm的半球形圆顶沉积于培养皿中（每毫升、或万个细胞），在含有75%BME和25%小鼠膀胱培养基的溶液中，制备小鼠膀胱类器官。如图4（A）所示，当这些细胞以每毫升个细胞打印时，在穹顶中仅观察到单个细胞，并且没有形成类器官。对以每毫升万个细胞接种的圆顶进行了类似的观察，发现细胞降解BME圆顶并向培养板迁移，培养实际上在2D的条件下进行。在图4（B）中，密度为每毫升个细胞的细胞成功通过打印形成类器官。如图所示，细胞结构内对比度的变化表明存在中央管腔，打印的类器官大致呈球形。综上，类器官形成的最佳细胞密度位于中间范围内，在该范围内，类器官可以在不太快降解周围基质的情况下形成。

类器官切片用苏木精-伊红（HE）染色以评估原始形态的保存。类器官的结构形态是保守的，并且在大多数类器官中清楚地显示了中心腔（图4（C））。如前所述，类器官有三到四个细胞层厚。此外，正如免疫染色所强调的，这些层反映了天然的尿路上皮结构。图4（D）显示了CD44包围每个细胞边缘的存在，从而确认类器官内的细胞是连接的。图4（E）证实了CK13在基底细胞层和中间细胞层中的存在，且这种标记物在中间细胞层中更为丰富，这可能表明基底层在类器官中没有完全发育。如图4（F）所示，CK5主要存在于打印类器官的外边缘，表明存在分化的基底层。对照实验中省略了一级抗体，只使用二级抗体染色切片的类器官，证实了用CD44、CK13和CK5抗体染色是特异性的。这些结果表明，该团队的微流控打印头可以可靠地打印出具有多个细胞层表达尿上皮特征标记的类器官。

图4小鼠尿路上皮细胞悬液打印后在体外形成膀胱类器官情况分析

该团队介绍了一种可将高密度细胞集中在生物3D打印喷头的设计和应用，能实时调节微挤出式打印的细胞密度，允许用户调整单元格密度实现按需打印。该团队通过这种方式制备了鼠膀胱类器官，证明细胞密度对建立细胞间相互作用的重要性。该生物3D打印的喷头系统设计可以很容易地适用于其他打印技术，使生物学家能够自由地设计细胞密度、打印材料、ECM浓度以及异质梯度等参数。

SerexLudovic,SharmaKunal,RizovVictor,BertschArnaud,McKinney,JohnD.,RenaudPhilippe.Microfluidic-assistedbioprintingoftissuesandorganoidsathighcellconcentrations.Biofabrication,.13(2):p.006.

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